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荧光光谱基础知识关键点涂装设备

顺宇机械网 2020-05-22 18:25:26

荧光发现历史

16世纪,西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes于1575年记录的“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中,呈现出极为可爱的天蓝色,被定义为第一次人类有记录的荧光现象。1852年,Stokes在考察奎宁和绿色素的荧光时,用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些,而不是由光的漫反射引起的,从而导入荧光是光发射的概念,完整提出荧光概念,也是第一个提出应用荧光作为分析手段的人。1867年,Goppelsr?de应用铝一桑色素配位化合物的荧光测定铝,这是历史上首次进行的荧光分析工作。

荧光的定义与形成机理

一般温度下,大多数分子处在基态的最低振动能级。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)后被激发为激发态。激发态是很不稳定的,它将很快地释放出能量又重新跃迁回基态。若分子返回基态时以发射电磁辐射(即光)的形式释放能量,就称为“发光”。如果物质的分子吸收了光能而被激发,跃迁回基态所发射的电磁辐射,称为荧光和磷光。

物质在吸收入射光的过程中,光子能量传递给物质分子。分子被激发,电子从较低能级跃迁到较高能级,形成电子激发态分子。电子的激发态的多重态用2s+1表示,s为自旋角动量量子数的代数和,数值为0或1。分子中同一轨道里所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向,即自旋配对。分子中全部电子都自旋配对,即s=0,该分子处于单重态,用S表示。若分子吸收能量后电子跃迁过程中不发生自旋方向的变化,这时分子处于激发的单重态;若跃迁伴随自旋方向改变,这时分子具有两个自旋不配对的电子,即s=1,分子处于激发的三重态,符号T表示。符号S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发单重态,T1和T2则分别表示第一和第二电子激发三重态。

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激发态的分子不稳定,可以通过辐射跃迁(荧光、磷光)和非辐射跃迁(振动弛豫、内转换、外转换、系间窜越)的失活过程返回基态。荧光是分子从第一激发单重态的最低振动能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射,荧光辐射能比激发能量低,荧光波长大于激发波长。荧光发射时间为10-9~10-7s,多为S1→S0跃迁。磷光是分子从第一激发三重态的最低振动能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射,磷光辐射能比荧光辐射能量低,磷光波长大于荧光波长。磷光发射时间为10-4~10s,多为T1→S0跃迁。

荧光光谱

任何荧光化合物都具有两个特征光谱:激发光谱和发射光谱。激发光谱反映了某一固定的发射波长下所测量的荧光强度对激发波长的依赖关系;发射光谱反映了某一固定激发波长下所测量的荧光的波长分布。

通过测量荧光(或磷光)体的发光通量(即强度)随激发光波长的变化而获得的光谱,称为激发光谱。通过扫描激发单色器,使不同波长的入射光照射激发荧光(磷光)体,发出的荧光(磷光)通过固定波长的发射单色器而照射到检测器上,检测其荧光(磷光)强度,最后通过记录仪记录光强度对激发光波长的关系曲线,即为激发光谱。通过激发光谱,选择最佳激发波长——发射荧光(磷光)强度最大的激发光波长,常用λex表示。

通过测量荧光(或磷光)体的发光通量(强度)随发射光波长的变化而获得的光谱,称为发射光谱。固定激发光的波长,扫描发射光的波长,记录发射光强度对发射光波长的关系曲线,即为发射光谱。通过发射光谱选择最佳的发射波长——发射荧光(磷光)强度最大的发射波长,常用λem表示。磷光发射波长比荧光来得长。

荧光光谱能够提供激发谱、发射谱、峰位、峰强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振度等信息,荧光分析定性和定量的基础。

荧光光谱的特点:1、Stokes位移:激发与发射之间存在着一定的能量损失,荧光发射波长总是大于激发波长,λem>λex;2、荧光发射光谱的形状与激发波长无关,荧光发射是激发态的分子由第一激发单重态的最低振动能级跃迁回基态的各振动能级所产生的,因此,不管激发光能量多大,荧光光谱只有一个发射带,且发射光谱的形状与激发波长无关。3、 荧光激发发光谱与吸收光谱的形状相近似,荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系。

荧光产生与分子结构关系

能够产生荧光的有机化合物和无机化合物必须有一定的结构特征,荧光产生与分子结构的关系如下:

1、能发射强荧光的有机化合物通常具有以下的结构特征:

1)、具有π-π* 电子跃迁类型的结构:大多数能发荧光的化合物都是由 π-π* 或n-π* 跃迁激发,然后经过振动弛豫等无辐射跃迁,再发生π*-π 或π-n 跃迁而产生荧光。 π-π*跃迁的类型是产生荧光的最主要跃迁类型。

2)、具有大的共轭π键结构:发生荧光(或磷光)的物质,其分子都含有共轭双键(π键)的结构体系。共轭体系越大,电子的离域性越大,越容易被激发,荧光也就越容易发生,且荧光光谱向长波移动。

3)、具有刚性平面结构:多数具有刚性平面结构的有机化合物分子都具有强烈的荧光,因为这种结构可以减少分子的振动,使分子与溶剂或其他溶质分子之间的相互作用减少,即可减少能量外部转移的损失,有利于荧光的发射。而且平面结构可以增大分子的吸光截面,增大摩尔吸光系数,增强荧光强度。

2、无机化合物的荧光:无机化合物的荧光有无机盐类的荧光和金属螯合物的荧光

1)、无机盐类的荧光:无机化合物本身能发荧光(或磷光)的不多,常见的主要有镧系元素(Ⅲ)的化合物,U(Ⅵ)化合物,类汞离子化合物Tl(Ⅰ)、Sn(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)、As(Ⅲ)、Sb(Ⅲ)、Bi(Ⅲ)、Se(Ⅳ)、Te(Ⅳ)等,以及某些过渡金属离子,如Cr(Ⅲ)等。

2)、金属螯合物的荧光:发荧光的无机离子与具有吸光结构的有机试剂发生配合作用,生成会发荧光的螯合物,可以进行荧光测定。这种能发荧光的螯合物可能是螯合物中配位体的发光,也可能是螯合物中金属离子的发光:(1)、螯合物中配位体的发光;(2)、螯合物中金属离子的荧光。

荧光寿命与荧光量子产率

荧光物质具有两个重要的发光参数:荧光寿命和荧光量子产率。荧光寿命(τ)是指当激发停止后,分子的荧光强度降到激发时最大强度的1/e所需的时间,它表示粒子在激发态存在的平均时间,通常称为激发态的荧光寿命。与稳态荧光提供一个平均信号不同,荧光寿命提供的是激发态分子的信息,前者可以告诉你事情发生了,而后者可以告诉你为什么发生。

荧光寿命与物质所处微环境的极性、黏度等有关,可以通过荧光寿命分析直接了解所研究体系发生的变化。荧光现象多发生在纳秒级,这正好是分子运动所发生的的时间尺度,因此利用荧光技术可以“看”到许多复杂的分子间作用过程,例如超分子体系中分子间的簇集、固液界面上吸附态高分子的构象重排、蛋白质高级结构的变化等。荧光寿命分析在光伏、法医分析、生物分子、纳米结构、量子点、光敏作用、镧系元素、光动力治疗等领域均有应用。

荧光寿命的测定技术有时间分辨单光计数技术(TCSPC)、相调法、闪频法。其中TCSPC具有灵敏度高、测定结果准确、系统误差小的优点,是目前最流行的的荧光寿命测定方法。

激发态分子的去激发包括两种过程,即无辐射跃迁过程和辐射跃迁过程,辐射跃迁可发射荧光(延迟荧光)或磷光,而有多少比例的激发分子发射出荧光和磷光,即可表示为荧光量子产率φf。荧光量子产率 --有时也叫荧光效率或荧光产率(或磷光量子产率φp )表示。φf 定义为:荧光物质吸光后所发射荧光的光量子数与所吸光的光量子数之比,即:

式中, kf为荧光发射过程的速率常数, ∑ki为其他有关过程的速率常数总和。一般来说, kf主要决定于化学结构,而 ∑ki主要决定于化学环境,同时也与化学结构有关。

荧光分析及其特点

目前荧光分析法已经发展成为一种重要且有效的光谱化学分析手段。在我国,50年代初期仅有极少数的分析化学工作者从事荧光分析方面的研究工作,但到了70年代后期,荧光分析法已引起国内分析界的广泛重视,在全国众多的分析化学工作者中,已逐步形成一支从事这一领域工作的队伍。

荧光分析就是基于物质的光致发光现象而产生的荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析方法。目前,也广泛地作为一种表征技术来研究体系的物理、化学性质及其变化情况,例如生物大分子构象及性质的研究。

荧光光谱适用于固体粉末、晶体、薄膜、液体等样品的分析。根据样品分别选配石英池(液体样品)或固体样品架(粉末或片状样品)。

荧光光谱分析可与显微镜耦合,获得微区分析结果。荧光是无损伤、非接触的分析技术,还可用于自动检验、批量筛分、远程原位分析和活体分析。

荧光分析特点:1、荧光分析的主要特点是灵敏度高、选择性好,荧光分析的灵敏度要比吸收光谱测量高2-3个数量级。分光光度法通常在 10-7级 ,而荧光的灵敏度达10-9。2、选择性强,荧光物质具有两种特征光谱:激发光谱和吸收光谱,相对于分光光度法单一的吸收光谱来说,荧光光谱可根据激发光谱和发射光谱来鉴定物质。 3、信息量丰富,能提供荧光物质的多种参数。4、荧光分析方法也有其不足之处:1)、很多物质本身不发荧光;2)、荧光的产生与化合物结构的关系不明确;3)、干扰因素多,光分解、氧淬灭、易污染。

荧光光谱定性与定量分析依据

荧光光谱定性分析:不同结构荧光化合物都有特征的激发光谱和发射光谱,因此可以将荧光物质的激发光谱与发射光谱的形状、峰位与标准溶液的光谱图进行比较,从而达到定性分析的目的。

荧光光谱定量分析:在低浓度时,溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成正比:F=Kc。其中,F为荧光强度,c为荧光物质浓度,K为比例系数。这就是荧光光谱定量分析的依据。该依据不适用于荧光物质浓度过高,其荧光强度反而降低。产生此类现象原因:1、内滤效应:1)、当溶液浓度过高时,溶液中杂质对入射光的吸收作用增大,相当于降低了激发光的强度。2)、浓度过高时,入射光被液池前部的荧光物质强烈吸收,处于液池中、后部的荧光物质,则因受到入射光大大减弱而使荧光强度大大降低;而仪器的探测窗口通常对准液池中部,从而导致检测到的荧光强度大大降低。2、相互作用:较高浓度溶液中,可发生溶质间的相互作用,产生荧光物质的激发态分子与其基态分子的二聚物或其他溶质分子的复合物,从而导致荧光光谱的改变和/或荧光强度下降。当浓度更大时,甚至会形成荧光物质的基态分子聚集体,导致荧光强度更严重下降。3、自淬灭:荧光物质的发射光谱与其吸收光谱呈现重叠,便可能发生所发射的荧光被部分再吸收的现象,导致荧光强度下降。溶液浓度增大时会促使再吸收现象加剧。荧光强度的影响因素还有溶剂、温度、pH值、散射光等,在定量分析中需要加以考虑。荧光光谱定量分析的计算与其他光谱类似,包括标准曲线法、比例法等。

荧光淬灭与淬灭剂

荧光的猝灭(熄灭)一词,从广义上说,指的是任何可使某给定荧光物质的荧光强度降低的作用,或者任何可使荧光强度不与荧光物质的浓度呈线性关系的作用。从狭义上说,指的是荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子之间的相互作用,导致荧光强度降低的现象。与荧光物质发生相互作用而使荧光强度降低的物质,称为猝灭剂。常见淬灭剂包括:卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合物等。荧光淬灭的主要形式有:碰撞淬灭(最主要的)、静态淬灭、转入三重态淬灭、发生电荷转移反应的淬灭、自淬灭。

基于荧光物质所发出的荧光被分析物淬灭,随着被分析物浓度增加,溶液的荧光强度降低,建立了荧光淬灭法。可以用来监控溶液中的微量氧、某些无机化合物的测定等。

荧光光谱应用领域

荧光光谱已应用于很多不同领域,特别是需要无损、显微、化学分析、成像分析的场合。无论是需要定性还是定量的数据,荧光分析都能快速、简便地提供重要信息。

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